Návrat na detail prednášky / Stiahnuť prednášku / Univerzita Pavla Jozefa Šafárika / Prírodovedecká fakulta / Histologia

Základy histologickej techniky (zaklady_histologickej_techniky.doc)

Základy histologickej techniky

Príprava preparátu pre svetelnú mikroskopiu

Aby sme mohli tkanivo alebo orgán študovať svetelným mikroskopom (v prechádzajúcom svetle), musí histologický preparát spĺňať niekoľko podmienok:

Vrstva tkaniva musí byť tenká a priesvitná.

Preparát musí byť kontrastný, aby sa dal od seba odlíšiť jednotlivé štruktúry.

Jednotlivé zložky tkaniva nesmú byť pozmenené posmrtným rozkladom, albo nešetrnými zásahmi pri odbere a ďalšom spracovaní tkaniva.

Tenkú priesvitnú vrstvu tkaniva môžeme získať viacerými spôsobmi. Z tekutých alebo riedkych tkanív môžeme urobiť náter (napr.z krvi, z kostnej drene)- Pomerne jednoduché je zhotovovanie roztlakového preparátu (kúsok tkaniva roztlačíme medzi dvoma podložnými sklíčkami alebo len pomocou krycieho sklíčka). Tieto jednoduché metodiky majú však obmedzené použitie, nehodia sa pre všetky druhy tkanív. Najčastejšie používanou metódou zhotovovania histologických preparátov je zhotovovanie rezov z tkaniva zaliateho v parafíne či celoidine, alebo rezanie zmrazeného tkaniva.

Príprava histologických rezov:

Excízia

Fixácia

Vypieranie

Odvodnenie

Prejasnenie

Impregnovanie parafínom

Zalievanie do parafínu

Rezanie na mikrotóme

Odparafinovanie

Farbenie

Vypieranie

Odvodnenie

Prejasňovanie

Uzavieranie

1.Excízia: odber vzoriek tkaniva

- odoberáme ich – z usmrteného zvieraťa (nekropsia)

                          - zo živého (biopsia)

Musíme dbať na to, aby bol odber vykonaný ihneď po usmrtení a vykrvení zvieraťa, ešte pred nástupom postmortálnych zmien. Odber robíme napr.žiletkou, sklapelom alebo nožnicami. Tkanivo nesmie byť pri odbere mechanicky poškodené. Hrúbka vzorky nemá byť viac ako 0,5cm, rezná plocha má mať max 1-2 cm2.

2.fixácia tkaniva:

- usmrtenie a súčasné konzervovanie tkaniva, ktorého cieľom je predísť postmortálnym zmenám. Vzorky tkaniva treba  fixovať čo najskôr.

Tkanivo môžeme fixovať – fyzikálne (napr.rýchle zmrazenie a súčasné vysušenie vo vákuu)

                                        - chemicky – najčastejšie pomocou chem.fixačných činidiel

Základná požiadavka pre fixačné činidlo – rýchly prienik tkanivom, aby sa obmedzila rozpustnosť zložiek cytoplazmy a zvýšila jej schopnosť prijímať rôzne farbivá.

Chemické fixačné činidla: najčastejšie – formalín, sublimát, alkohol, kyselina pikrová, oxid osmičelý (OsO4). Veľmi často sa používajú kombinácie viacerých látok. Vzorky tkaniva sa vkladajú do fixačných roztokov v gízových vrecúškach, pričom dbáme, aby bolo dosť fixačného roztoku (20-40 násobok objemu vzoriek).

Fixačný roztok sa môže aplikovať aj priamo do cievneho riečisťa zvieraťa – perfúzia.

Najčastejšie používané fixačné roztoky:

a) formalín – je 36 – 40% roztok plynného formaldehydu vo vode.

b) alkohol – používa sa v 70% koncentrácii; dĺžka fixácie je 1-5 hodín.

c) alkohol a parafín – 2 diely 80-90% alkoholu a 1 diel formaldehydu; dĺžka fixácie je 1-2 dni.

d) Zenkerov roztok – obsahuje Mullerov sublimát a ľadovú kyselinu octovú- Dĺžka fixácie je 1-24 hod., vypieranie v tečúcej vode 24 hodín. Zloženie Mullerovho sublimátu: Kalium bichromicum – 25,0g, destilovaná voda – 1000ml, krátko zovrieť a pridať Hydrargyrum bichloratum (sublimát – 50,0g).

e) Hellyho roztok – ak k Zenkerovmu roztoku pridáme formalín (40%); dĺžka fixácie 1-6 hodín, vypieranie v tečúcej vode 24 hodín.

f) Heidenheinov roztok (Susa) – dĺžka fixácie je 1-24 hodín, po fixácii preniesť priamo do 80% alkoholu.

g) Bouinov roztok – dĺžka fixácie je 24 hodín a viac. Nevypiera sa vo vode, ale v 70% alkohole.

3.vyperanie

- po skončení fixácie treba tkanivo zbaviť fixačného činidla vypieraním v tečúcej vodovodnej vode. Pri niektorých fixačných roztokoch sa vzorky prenášajú priamo do akolholu. Vypieranie zvyčajne trvá 24 hodín.

4.odvodnenie

- vzorky prenášame cez rad alkoholov o stúpajúcej koncentrácii (50%-70%-96%-100%-100%II-100%III). Tkanivo určené na rezanie zmrazovacím mikrotómom neodvodňujeme.

5.prejasnenie

- odvodnené tkanivo môžeme zaliať do parafínu až potom, čo ho zbavíme alkoholu. Použijeme na to činidlo, ktoré sa mieša s alkoholom, ale je súčasne rozpúšťadlom pre parafín – teda benzén (alebo xylén). Účinkom benzénu sa tkanivo prejasní – je skoro piesvitné. Nesmie byť v benzéne (3 benzénové kúpele, benzénI – 15min., benzénII – 15min., benzénIII – 15min.) príliš dlho, aby nestvrdlo.

6.impregnovanie a zalievanie do parafínu

- vzorky tkaniva presycujeme parafínom (parafínI-2hod., parafínII-4hod., parafínIII- 12-16hod.). Pri zalievaní má parafín teplotu 56-58oC. Vzorky tkaniva presýtené parafínom sa vkladajú do papierových formičiek, zalenjú sa nahriatym rozpusteným parafínom a nechajú sa stuhnúť pri izbovej teplote. Po stuhnutí parafínu sa z formičiek vylúpnu, upravia nožon na potrebnú veľkosť a sú pripravené na rezanie.

Pri zalievaní do celoidinu sa vzorky najprv prenášajú cez alkohol a éter a potom celoidin o stúpajúcej koncentrácii (2%-4%-6%-8%-10%). Bločky presýtené celoidínom sa nožom z nádoby vykroja, vložia do 70% alkoholu, tu stvrdnú a sú vhodné na rezanie.

7.rezanie na mikrotóme

- mikrotómy sú prístroje na rezanie tenkých rezov 5-10µm.

Typy mikrotómov – sánkový – pohybujú sa sane s mikrotómovým nožom

                                               - režeme nim materiál zaliaty v parafíne a celoidíne

                             - ratačný – nôž je upevnený a pohybujemebločkom s tkanivom

                                            - na rezanie parafínových preparátov

Po narezaní sa parafínové rezy vyrovnávajú teplom a lepia na podložné sklíčko. Po usušení sú histologické rezy pripravené na farbenie.

8.odparafínovanie rezov

- pred farbením sa rezy musia zbaviť parafínu v xyléne a preniesť cez rad alkoholov (klesajúca koncentrácia) do destilovanej vody äxylén-5min., absolútny alkohol-2min., alkohol 96%-2min., alkohol 70%-4min., destilovaná voda-3min.)

9.farbenie

- sklíčko s rezom ponárame do farbiacich roztokov, slúžia na to špeciálne kyvety s priehradkami. Rezy po zafarbení prenesieme cez vzoskupný rad alkoholov a prejasníme ich v xyléne.

10.uzavieranie

- takto pripravené histologické preparáty aby boli trvalé, uzatvoríme do kandského balzamu, glycerín-želatíny, alebo Entelanu. Na rez kvapneme kvapku uzatváracieho média a prikryjeme krycím sklíčkom. Zvyčajne sa takto pripravené rezy nechajú schnúť v termostate, príp.pri izbovej teplote.

Farbenie histologických preparátov

- jeho hlavným cieľom je dosiahnúť kontrast jednotlivýcj štruktúr tkaniva, ktoré byv prechádzajúcom svetle nevynikli. K tolu slúžia histologické, hlavne syntetické farbivá.

Farbenie. a) prehľadné – ak pri kombinácii niekoľkých farbív sa odlišne zafarbia jadrá buniek, cytoplazma a iné štruktúry, čím získame prehľad o študovanom tkanive.

               b) špeciálne – ak ide o zvýraznenie niektorej štruktúry (napr.elastických vláken), ktorá sa zafarbí len určitým farbivom

                                    !!! na zvýraznenie niektorých štruktúr sa používajú iné ako farbiace etódy, napr.impregnácia soľami striebrra – nervové bunky a nervové vlákna

Farbivá: kyslé – napr.eozín. kyslý fuchsín, anilínová modrá, oranž G

             Zásadité (bázické) – hematoxylín, toluidínová a metylénová modrá

Pri bežne farbiacich metódach sa používajú aspoň 1 bázická a 1 alebo 2 kyslé farbivá.

Rôzne štruktúry sa farbia rôznymi farbivami.

Bazofília – jav, keď sa štruktúry, ktoré obsahujú kyslé zložky napr. nukleové kyseliny v jadre alebo cytoplazma buniek bohatá na granulované endoplazmatické rtetikulum, farbia bázickými farbivami.

Eozinofília – keď sa štruktúry, ktoré obsahujú zásadité zložky – bielkoviny vo svalových, kolagénových vláknach, erytrocyty, cytoplazma s mitochondriami, ER, farbia kyslími farbivami.

Najpoužívanejšie prehľadné histologické farbenia:

1. farbenie Hematoxylínom a eozínom (H&E) – najpoužívanejšie

                                                                          - hematoxylín farbí jadrá – fialové

                                                                       - eozín farbí cytoplazmu – ružová

- svalovina je ružovočervená, erytrocyty                        sú   červenooranžové alebo červené a kolagénové vlákna sú ružové    

2. farbenie Azokarmin-Mallory „Azan“ – 3 farbivá: azokarmín, anilínová modrá, oranž G

- výsledok farbenia: jadrá červené, svalovina  oranžovočervená, kolagénové vlákna modré, hlien je modrý  

3. farbenie Trichrom podľa Crassmona – 4 farbivá: Weigertov hematoxylín (bázický), ktorý farbí jadra na čierno, fuchsín (kyslý) farbí cytoplazmu na fialovo, oranž G (kyslý) farbí granuly v bunkách a svetlá zeleň (kyslý), ktorá farbí kolagénové vlákna na zeleno.

Špeciálne histologické farbiace metódy

Farbenie elstínu rezorcinovým fuchsínom – elastické vlákna sú modročierne, ostatné tkanivo okrem chrupky je svetlosivé.

UPJŠ Košice

(Meris-Anch)