Návrat na detail prednášky / Stiahnuť prednášku / Univerzita Komenského / Prírodovedecká fakulta / Biochemická variabilita

4 (izolacia.doc)

Molekulárne metódy

Vybavenie molekulárno-biologického laboratória  veľmi závisí na metódach, ktoré sa v nich realizujú a ktoré sa môžu veľmi líšiť. Ťažko by sme hľadali nejaký štandard. Vďaka radikálnemu pokroku sa naviac obraz laboratória môže behom niekoľkých rokov zmeniť k nepoznaniu. V starších laboratóriách dominovali mohutné inkubátory pre množenie baktérií a mohutné centrifúgy na veľké objemy. V modernom laboratóriu sa stretneme skôr s automatickými pipetami, malou stolnou centrifúgou, termocyklerom alebo sekvenátorom.

Izolácia DNA

Pri analýze komplexných genómov metódami molekulárnej biológie je nevyhnutné izolovať čistú, vysokomolekulárnu DNA. Vzhľadom na veľkosť DNA v jednotlivých chromozómoch eukaryotických organizmov, ktorá dosahuje až niekoľko desiatok miliónov báz, je technicky veľmi náročné izolovať neporušené molekuly DNA v plnej dĺžke a manipulovať s nimi v in vitro podmienkach. Pre väčšinu experimentov to však ani nie je potrebné a úplne postačujúca je fragmentovaná DNA s dĺžkou fragmentov 70-150 kb.

Postup izolácie DNA obyčajne závisí od organizmu, z ktorého pri izolácii vychádzame. Cieľom izolácie je získať DNA s čo možno najväčšou relatívnou molekulovou hmotnosťou bez RNA, proteínov, polysacharidov. Všetky metódy izolácie genómovej DNA z tkanív živočíchov a rastlín sú založené na troch základných krokoch:
1. šetrnej lýze buniek,
2. odstránení proteínov a ostatných vysokomolekulárnych zložiek bunky okrem DNA (tzv. čistenie – purifikácia DNA),
3. skoncentrovaní DNA najčastejšie zrážaním.

Nevyhnutným predpokladom kvalitnej extrakcie DNA je dôkladné rozrušenie buniek a ich súčastí, ktoré prebieha obvykle v prostredí príslušného extrakčného média. Extrakčné médiá používané pri izolácii nukleových kyselín sa zvyčajne skladajú zo základného tlmivého roztoku, ku ktorému sa pridávajú deproteinizačné činidlá, detergenty a inhibítory nukleáz. Pri izolácii DNA z eukaryotických buniek, kde DNA tvorí pevné komplexy s histónovými a ďalšími proteínmi, do extrakčného roztoku pridávajú enzýmy proteázy (pronáza a proteináza K). Proteináza K bola izolovaná z baktérie Tritirachium album. Prednostne štiepi peptidové väzby po karboxylovej skupine N-substituovaných aminokyselín, čím hydrolyzuje natívne proteíny. Z deproteinizačných prostriedkov sa na izoláciu nukleových kyselín najčastejšie používa fenol a chloroform, alebo sa proteíny vyzrážajú nasýtenými roztokmi solí, napr. NaCl alebo octanom sodným (tzv. vysoľovanie). Fenol patrí medzi najefektívnejšie denaturačné činidlá. Nevýhodou fenolu je jeho vysoká toxicita. Na izoláciu nukleových kyselín sa používa redestilovaný fenol nasýtený tlmivým roztokom. Závislosť uvoľnenia nukleovej kyseliny od pH fenolového extrakčného roztoku možno použiť na súčasné oddelenie DNA a RNA. Ak pH fenolového roztoku je 5,0, do vodnej fázy prechádza len RNA, kým DNA zostáva nerozpustná. Pri zvyšovaní pH prostredia prechádza do roztoku i DNA a pri pH fenolového roztoku 7,4 možno tento druh nukleovej kyseliny kompletne extrahovať do vodnej fázy extrakčného média. Na odstránenie zvyškov fenolu sa využíva zmes chloroformu s izoamylalkoholom v pomere 24 : 1. Chloroform tiež denaturuje bielkoviny, izoamylalkohol znižuje penenie zmesi, uľahčuje oddelenie vrstiev pri centrifugácii a udržuje ich stabilitu. Detergenty (SDS alebo N-lauryl sarkozín) pomáhajú deproteinizácii, pretože účinne uvoľňujú nukleové kyseliny z ich väzby na bielkoviny. Na vyzrážanie bielkovín je možné použiť aj roztoky solí, čo predstavuje výhodu v nahradení zdraviu škodlivých zlúčenín (fenol) neškodnými (NaCl), účinnosť deproteinizácie je však nižšia. Aktivita nukleáz – enzýmov, ktoré sa prirodzene vyskytujú v bunkách a degradujú DNA - sa inhibuje komplexotvornými činidlami, najčastejšie roztokom EDTA, pretože EDTA viaže ióny (napríklad Mg2+), ktoré nukleázy vyžadujú ku svojej aktivite. Aktivita nukleáz sa potlačí aj tým, že proteolytické štiepenie sa realizuje pri teplote až 60°C v prítomnosti ionogenných detergentov (SDS), ktoré tak isto inhibujú nukleázy. Posledným krokom v procese izolácie DNA je jej vyzrážanie 95% etanolom alebo izopropylalkoholom, pričom na odstránenie solí zo vzorky sa využíva premývanie 70% etanolom.

V súčasnosti existuje množstvo metodík izolácie nukleových kyselín z rôznych zdrojov. Mnohí výrobcovia dodávajú celé súpravy chemikálií (tzv. kity) určené pre izoláciu DNA z konkrétneho zdroja s vysokou účinnosťou. Vo všeobecnosti sa DNA najčastejšie izoluje z krvi, z chlpovej cibuľky, buniek sliznice ústnej dutiny, prípadne zo svalu alebo iných tkanív. DNA z rastlinných pletív sa izoluje ťažšie v porovnaní so živočíšnymi tkanivami vďaka pevnej bunkovej stene. Na jej rozrušenie sa používajú rôzne zmesi enzýmov (izolované napr. z Trichoderma reesei) alebo sa bunková stena rozruší pomocou tekutého dusíka.