Návrat na detail prednášky / Stiahnuť prednášku / Univerzita Komenského / Prírodovedecká fakulta / Biochemická variabilita

9 (separacia_nukleovych_kyselin.doc)

Separácia nukleových kyselín

Separácia (frakcionácia) nukleových kyselín je v podstate oddelenie rôznych molekúl DNA (alebo RNA) na základe veľkosti, zloženia a poradia báz. Rovnako účinne možno podobnými technikami separovať aj proteíny, ku ktorým sa pripája ešte možná separácia podľa celkového náboja (nepolárne, polárne, záporne a kladne nabité aminokyseliny). Nukleové kyseliny sú kyslé (z toho aj názov - kyseliny) v dôsledku prítomnosti fosfátovej skupiny (fosfátovej kostry).

Elektroforéza

Elektroforéza (skratka ELFO) využíva schopnosť nukleových kyselín putovať ku kladne nabitému pólu (k anóde; záporne nabitá je katóda). Elektroforéza prebieha v elektroforetickej aparatúre v gélovitých roztokoch, ktoré vytvárajú sieťovitú štruktúru, čím separujú molekuly odlišujúce sa tvarom a veľkosťou. Čiara/priamka, v ktorej sa pohybujú DNA fragmenty od katódy k anóde pochádzajúce z jednej vzorky, nazýva sa dráha. V dráhe sú jednotlivé DNA fragmenty určitých dĺžok viditeľné ako prúžky. V prvej a/alebo poslednej dráhe sú spravidla štandardy molekulových hmotností (angl. DNA ladder), v ktorých sa separujú presne veľkostne definované DNA fragmenty (100 bp, 200 bp, 500 bp...) umožňujúce odhadnúť neznáme veľkosti DNA fragmentov vo zvyšných dráhach.

Rýchlosť pohybu nukleových kyselín v géli závisí od niekoľkých faktorov:

1. veľkosť NK
   Menšie molekuly prechádzajú gélom rýchlejšie, pretože sa ľahšie pohybujú v sieťovitej štruktúre gélu. Veľkosť jednotlivých prúžkov možno odčítať zo štandardu molekulových hmotností. Pri začiatku gélu sa DNA pohybuje pomalšie ako pri jeho konci, takže vzdialenosti medzi jednotlivými prúžkami v DNA ladderi nie sú proporcionálne.
2. konformácia NK
   Značí rôzny tvar v prípade separácie jednovláknových molekúl (ssDNA alebo ssRNA), ktorý nadobúdajú nukleové kyseliny ako dôsledok vnútromolekulových párovaní báz. Dochádza k tvorbe sekundárnych štruktúr, ktoré ťažšie prechádzajú gélom. Tento fakt využívajú niektoré elektroforetické techniky, pretože dokáže odhaliť aj zámeny jedinej bázy (odlišné vnútromolekulové párovanie a výsledný tvar molekuly). Ak nás zaujíma odlíšenie prúžkov jednovláknových DNA alebo RNA len na základe veľkosti, môžeme použiť denaturačné činidlá, ktoré pokryjú nukleovú kyselinu negatívnym nábojom a znemožnia jej vnútromolekulové párovanie.
3. forma NK
   Súvisí v podstate s predchádzajúcim bodom. Superšpiralizované plazmidy sa pohybujú v géli pomalšie ako relaxované kruhové formy, pričom najrýchlejšie sa v géli pohybuje lineárna forma DNA.
4. koncentrácia gélu
   Hustejší gél vytvára aj hustejšiu sieťovitú štruktúru, ktorá sa viac hodí na lepšiu separáciu menších fragmentov.
5. napätie elektroforetickej aparatúry
   Čím vyššie je napätie, tým rýchlejšie prebieha separácia, ale zároveň sa tým uvolňuje viac tepla, ktoré zohrieva aparatúru a môže interferovať s delením. Vyššie napätie môže byť aj príčinou "rozmazaných" prúžkov.

Elektroforetické tlmivé roztoky

Aby sa zachovali stabilné podmienky počas separácie, gél je v elektroforetickej aparatúre ponorený do tlmivého roztoku (pufrovací roztok, pufor) (angl. buffer). Elektroforetické tlmivé roztoky zabezpečujú ióny, ktoré vedú elektrický prúd pri elektroforéze. Medzi najpoužívanejšie patria:

Nanášacie tlmivé roztoky (angl. loading buffer) pre elektroforézu zabezpečujú zvýšenie hustoty roztoku (sacharóza, glycerol, ficoll) (aby pri nanášaní na gél klesol na dno) a obsahujú farbivá (brómfenolová modrá, xylencyanol), ktoré sa pri elektroforéze pohybujú rovnakým smerom ako DNA a do istej miery umožňujú sledovať jej priebeh. Príklad zloženia typického nanášacieho roztoku, ktorý sa na gél nanáša spolu so vzorkou DNA:

40% sacharóza
0,25% brómfenolová modrá
0,25% xylencyanol

Vizualizácia DNA

Samotná DNA je počas separácie v géli neviditeľná. Vizualizuje (zviditelňuje) sa najčastejšie použitím fluorescenčného činidla - etídiumbromidu (skratka EtBr), kde ju v jednotlivých dráhach vidno ako spomínané prúžky. Etídiumbromid sa včleňuje (interkaluje) medzi susediace bázy DNA a po ožiarení UV svetlom oranžovo fluoreskuje. Za určitých okolností možno etídiumbromid pridať priamo do (agarózového) gélu a priebežne kontrolovať pozíciu DNA fragmentov na géli (tiež vystavením UV svetlu). EtBr patrí medzi najúčinnejšie chemické mutagény, takže je nutné prísne dodržovať bezpečnostné predpisy!

Elektroforetické gély

V závislosti od povahy elektroforetických gélov rozlišujeme dva hlavné typy:

1. agarózový gél
2. polyakrylamidový gél

Elektroforéza v agarózovom géli

Agaróza je lineárny polymér D-galaktózy a galaktózového derivátu (3,6-anhydro-L-galaktózy), ktorý sa získava purifikáciou agaru (výťažok z červených rias). Umožňuje rozlíšiť DNA fragmenty veľkosti od 50 bázových párov po niekoľko megabáz (milión báz), tradične sa však používa pre rozlíšenie fragmentov od 0,1-20 kilobáz (tisíc báz). Možno použiť gély s koncentráciou 0,1-3% agarózy (najčastejšie 1 až 1,5%), pričom hustejšia agaróza rozdeľuje efektívnejšie menšie fragmenty ale DNA v nej putuje celkovo pomalšie, takže je potrebný dlhší čas separácie (pri rovnakom napätí aparatúry).

Agaróza je jemný prášok, ktorý sa rozvára v pufri (najčastejšie TAE) a nalieva do formy ("vaničky"). Vo forme je založený hrebeň, ktorý svojimi zárezmi vymodeluje po stuhnutí gélu jamky na nanášanie DNA. DNA sa do jamiek pipetuje rozriedená v nanášacom pufri. Gél aj s formou sa potom vložia do elektroforetickej aparatúry tak, aby jamky boli umiestnené bližšie ku katóde (-). Agarózový gél musí byť v aparatúre ponorený v rovnakom pufri, v akom bola agaróza rozváraná! Agarózová gélová elektroforéza "beží" v horizontálnej elektroforetickej aparatúre, tzn. vodorovne s povrchom stola.

Elektroforéza v polyakrylamidovom géli

Polyakrylamidový gél (skratka PAGE) vzniká polymerizáciou akrylamidu (C3H5NO). Je to biela kryštalická látka ľahko rozpustná vo vode. PAGE gély majú rozlišovaciu schopnosť až 1 bázový pár, takže sú vhodné aj na sekvenovanie DNA, tzn. určovanie poradia nukleotidov; na druhej strane sa však nehodia na separáciu veľkých fragmentov (rozdiel viac ako 200 báz). Používajú sa koncentrácie 4-12% gélu (najlepšie 6-10%).

Akrylamid vytvára lineárne reťazce. Aby gél tvoril sieť, v ktorej bude migrovať DNA, používa sa malé množstvo bisakrylamidu, ktorý svojou štruktúrou umožňuje vetvenie reťazcov. Polymerizácia akrylamidu neprebieha spontánne, ale sú k nej potrebné látky, ktoré iniciujú formovanie polymérov a spúšťajú reťazovú polymerizáciu. Peroxodisíran amónny (skrátene persíran amónny, skratka APS) iniciuje formovanie gélu tým, že atakuje molekuly ďalšej látky - TEMEDu (skratka pre istý kvartérny amín) - ktorý tvorí ióny narušujúce reaktívne skupiny akrylamidu, ten potom reaguje s ďalšou molekulou akrylamidu, pričom už sám z nej vytvára ďalšiu reaktívnu látku až vzniká dlhý polymér.

Zmes na prípravu 10 ml polyakrylamidového gélu môže mať nasledovné zloženie:

4% PAGE:
1 ml 40% akrylamid/bisakrylamid (19:1)
2 ml 5x TBE
10 µl TEMED
50 µl 10% APS
6,94 ml destilovaná H2O

6% PAGE:
1,5 ml 40% akrylamid/bisakrylamid (19:1)
2 ml 5x TBE
10 µl TEMED
50 µl 10% APS
6,44 ml destilovaná H2O

Pripravené zložky sa zmiešajú, pričom nakoniec sa pridajú katalyzátory polymerizácie TEMED a persíran amónny. Pripravená zmes sa naleje medzi dve sklá a nechá sa polymerizovať. Takto vytvorené gély sa spolu so sklami použíjú na elektroforézu. Elektroforéza v PAGE géli "beží" vo vertikálnej elektroforetickej aparatúre (tzn. kolmo na povrch stola), pričom ako pufor sa do aparatúry používa častejšie TBE. Katóda (-) je orientovaná navrchu a anóda (+) na spodnej strane aparatúry, takže fragmenty DNA migrujú zhora nadol.